在生物医学研究中，目的蛋白常以多种形式存在，糖基化是最常见的翻译后修饰之一。接受糖基化的氨基酸包括丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、天冬酰胺（Asn）以及羟赖氨酸（Hydroxylysine）。以CD2为例，根据Uniprot预测，它的分子量约为39kDa，而实际观察到的表观分子量则在45kDa左右，这一差异主要是由于多个位点的糖基化修饰引起的。在实验中，为了确认分子量差异是否由糖基化引起，可以使用糖苷酶PNGase F切除糖基，随后进行西方印迹（WB）分析。

另外还有磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化等多种翻译后修饰，其中糖基化、乙酰化和甲基化通常会导致表观分子量增加，而磷酸化则可能不变或小幅增加。

剪切也是蛋白质形式变化的重要因素。例如，Caspase-7存在多种形式：

• Procaspase-7：前体形式，分子量约为37kDa；
• Intermediate Caspase-7：中间形式，分子量约为28kDa；
• Caspase-7 p20：活化片段，分子量约为20kDa。

Procaspase-7在细胞受到凋亡信号后通过自身或其他Caspases切割激活，形成较小的活性亚单位，这些亚单位结合形成有活性的异二聚体。此过程可通过设置诱导组与非诱导组进行验证。剪切后的表观分子量通常会减小。

在电泳过程中，对于分子量小于20kDa的蛋白，其分离效果较差。例如，传统的Tris-Glycine体系在SDS-PAGE中，小型蛋白质可能受到离子前峰的影响，导致条带模糊和分辨率降低。为了更好地分离这些小分子量蛋白质，推荐使用Tricine-SDS-PAGE体系，以提高分离效果。

此外，标记问题也值得关注。与非预染标记相比，预染标记由于偶联染料的原因，可能会出现分子量偏移。样本制备时，例如膜蛋白的加热变性，可能引起聚集现象，导致检测条带的表观分子量增加。为确保测定准确，样本制备时应使用新鲜、完整的裂解液，并注意抗原表位的暴露。

在解决以上问题时，关键在于确认样本中是否表达目的蛋白及其表达丰度，并查阅厂家的验证图，了解抗体的特异性。这将为西方印迹实验提供可靠的依据。

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